Sampai dengan tahun 1927, daerah yang sekarang menjadi keuskupan Purwokerto masih menjadi bagian Vikariat Apostolik Batavia. Pada tahun 1927 inilah, reksa pastoral wilayah ini dipercayakan oleh Paus kepada kongregasi Missionaris Hati Kudus Yesus (MSC). Karya misi ini dipersembahkan kepada Kristus Raja, maka karya misi ini juga dinamakan dengan misi “Kristus Raja”.
Pada bulan Oktober 1927, datanglah para misionaris pertama: Pater BJJ. Visser MSC, Pater de Lange MSC, dan Pater B. Thien, MSC. Sejak tahun ini berdirilah Yayasan Pius yang kemudian diikuti dengan berdirinya beberapa sekolah: Hollandsch Chineesche School de Piusstichting Tjilatjap (1933), Vackschool Baroe (Tjilatjap 1933), Opening Vackschool and Internaat (Wonosobo 1939), serta perkembangan yang menggembirakan, seperti pembangunan beberapa gereja paroki: peresmian gereja Purworejo pada 13-15 Agustus 1933, penerbitan buku-buku sebagai sarana katekese misalnya: “Ilmoe Jang Benar” pada tahun 1938, “Kehidoepan Kekal” pada tahun 1935, “Sembahjangan Padinan” pada tahun 1939 dan pendirian Perfectur Apostolik Purwokerto pada tahun 1932.
Pada tanggal 16 Desember 1949, Mgr. W. Schoemaker, MSC diangkat menjadi Vikaris Apostolik Purwokerto dan mulailah dikenal perangkat-perangkat pelayanan umat, seperti Madjakat (Madjelis Aksi Katolik) yang didirikan pada 4 April 1955, dan juga Kelas Persiapan Pertama (Probatorium) pada Juli 1949 yang kemudian menjadi Seminari Minus Purwatapa (1 Agustus 1951)
Pada tahun 1961, Mgr. W. Schoemaker MSC ditunjuk untuk memimpin Keuskupan Purwokerto dan pada tahun 1974, diteruskan oleh Mgr. Paskalis Hardjasumarta MSC hingga tahun 1999. Mgr. Julianus Sunarka, SJ melanjutkan kepemimpinan pendahulunya sejak tahun 2000 hingga 2016, dan sejak tahun 2018 hingga sekarang, Keuskupan Purwokerto dipimpin oleh Mgr. Christophorus Tri Harsono.